Abstrato
Objectivo:
O consumo de álcool, devido aos efeitos prejudiciais em vários tecidos, incluindo o sistema nervoso, causa um grande problema nas sociedades humanas. Hoje em dia, é comum o uso de agentes não farmacológicos e não invasivos. As ondas sonoras que são classificadas como agentes não invasivos, além de estimularem as células auditivas, também impactam nas células não auditivas. Foi relatado que a frequência de 528 HZ está relacionada à nota MI e mostrou alguns efeitos estranhos, como aumentar a capacidade de reparo do DNA.
Materiais e métodos:
Neste trabalho, com ensaios de MTT, LDH e ROS, foi avaliado o efeito do etanol em cultura de células primárias de astrócitos expostos a esta frequência.
Resultados:
Os resultados atuais mostram que no IC50 do etanol, a frequência de 528 Hz aumentou a viabilidade das células em cerca de 20% e o nível de produção de ROS foi reduzido em até 100%.
Conclusão:
Portanto, o uso destas ondas sonoras pode ser útil para reduzir os efeitos tóxicos do etanol na cultura de células de astrócitos.
Palavras-chave:
Sistema nervoso; Onda sonora de 528 Hz; Astrócito; Produção de ROS; Etanol.
Introdução
A dependência de álcool é um distúrbio crônico recorrente que se caracteriza por padrões repetitivos de consumo de álcool, levando à perda de controle devido à ingestão de álcool [1,2]. Estudos experimentais mostraram as alterações estruturais e funcionais em neurônios e astrócitos com consumo crônico de álcool [3,4]. Algumas alterações, como função cognitiva e desempenho motor grosso fino, também são observadas em crianças pela síndrome alcoólica fetal [5]. O etanol altera a estrutura física da membrana celular e afeta particularmente as membranas com baixo colesterol. Por outro lado, o etanol aumenta os ácidos graxos saturados e o colesterol na membrana, o que reduziria o efeito do etanol [6]. O abuso de álcool causa distúrbios na plasticidade sináptica e na função neuronal relacionada à plasticidade sináptica [7]. As alterações neurais induzidas pelo consumo de álcool podem estar relacionadas ao distúrbio de vias de sinalização, como expressão proteica e transcrição gênica em nível celular [8,9].
O sistema nervoso central (SNC), constituído por neurônios e células gliais, é o principal alvo da toxicidade do etanol. A maioria das células gliais são astrócitos que são dez vezes mais do que a população de neurônios no SNC. Os astrócitos desempenham um papel importante para o crescimento normal e a função neural. As células da glia cobrem contiguamente todo o SNC e exercem muitas funções complexas essenciais [10]. Várias neurotoxinas podem apresentar vários efeitos nas células dos astrócitos [11]. Muitas pesquisas confirmaram que o consumo crônico de etanol prejudica seriamente o crescimento das células dos astrócitos [12,13]. Devido ao importante papel das células astrocitárias na função normal do SNC, o efeito de agentes externos nas células astrocitárias afeta a função cerebral. Fatores mecânicos, incluindo ondas sonoras e ondas eletromagnéticas, como importantes agentes externos com fontes diferentes, podem afetar os sistemas biológicos. Os efeitos biológicos das ondas eletromagnéticas foram extensivamente estudados. Por outro lado, estamos frequentemente expostos a diferentes ondas sonoras com diversos efeitos biológicos. Além disso, a avaliação destes efeitos desempenha um papel essencial na melhor compreensão das alterações biológicas. Estudos recentes indicaram que além das células auditivas, outras células também são capazes de responder a ondas sonoras audíveis. Por outro lado, a sensação de pressão e vibração associada às ondas sonoras, causada pelo impacto das ondas nas células do tórax e da garganta [14,15]. Uma pesquisa em cultura de fibroblastos gengivais humanos mostrou que a frequência de 261 Hz poderia alterar o crescimento celular e também observou que a estimulação das ondas sonoras poderia causar mudanças dramáticas na estrutura proteica das células do tabaco, incluindo o aumento da hélice alfa e a diminuição da volta β. Os efeitos das ondas sonoras de 1 kHz e 100 dB por 1 h a uma distância de 20 cm podem aumentar drasticamente a fluidez da parede celular, a divisão das células do calo e o poder dos hormônios endógenos e também aumentar a atividade das enzimas protetoras. A estimulação das ondas sonoras pode aumentar a atividade da ATPase na membrana plasmática da planta, a quantidade de proteínas solúveis, açúcares e a atividade da amilase no calo. As ondas sonoras também poderiam aumentar as quantidades de RNA e transcrição nas células do planeta, nas quais genes induzidos por diferentes tipos de estresse sonoro poderiam produzir produções mais eficazes [16]. 528 Hz, conhecido como tom ‘Milagre’, é uma onda sonora que pode causar mudanças significativas e extraordinárias nas funções biológicas. Foi documentado que a frequência de 528 Hz ativou o reparo do DNA. Na frequência de 528 Hz, as moléculas de água circundam o DNA e sustentam sua estrutura hexagonal de DNA de seis lados [17]. De acordo com esses importantes efeitos da frequência de 528 Hz, sugerimos que esta onda sonora terá um papel fundamental no funcionamento do SNC. Nesta pesquisa foram estudados os efeitos complexos de dois agentes como o etanol juntamente com a onda sonora de 528 Hz e os resultados da cultura de células de astrócitos humanos expostos ao etanol e à onda sonora de 528 Hz mostraram que os danos do etanol são reduzidos pela onda sonora e, portanto, podem ser útil para pessoas viciadas em álcool.
Materiais e métodos
Culturas celulares primárias
Astrócitos humanos fetais obtidos do Laboratório BONYAKHTEH em Teerã. Todas as células foram cultivadas em frasco estéril de 160 mL com meio DMEM e 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O meio foi trocado a cada dois dias e permaneceu em cultura por 11 dias até atingir o formato confocal. Em seguida, o meio foi removido e 1 ml de solução de tripsina-EDTA foi adicionado a cada frasco por 5 min a 37 ° C e fluxo de 5% de CO. Para inativação da tripsina utilizou-se a adição de 1 ml de FBS/frasco complementado com penicilina/estreptomicina e 150 mM de FBS. As células foram centrifugadas a 300x g durante 4 min. Em seguida, as células foram contadas usando um hemocitômetro. Em seguida, as células foram enxaguadas com tampão fosfato estéril para remover a tripsina.
Tratamento de cultura celular com etanol e onda sonora
Tratamentos de cultura celular com etanol 25 mM, 50 mM, 85 mM, 110 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM e as células foram expostas à onda sonora de 528 Hz produzida por quatro alto-falantes (Adam AX8), circundando a cultura celular na mesma distância , que ficavam suspensos por uma pequena plataforma, e sem contato com o chão. Como controle, as células foram expostas ao silêncio (qualquer alto-falante da incubadora) e aos alto-falantes conectados ao computador sem qualquer produção sonora, para observar uma possível ação do ruído de fundo ou do campo magnético produzido pelos alto-falantes. A frequência da onda sonora produzida pelo software Matlab (dispositivo produtor de som é composto por quatro alto-falantes vinculados ao software Matlab do computador).
Viabilidade celular
O número de células viáveis foi determinado utilizando exclusão padrão de azul de tripano.
As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois ressuspensas com EDTA e depois coradas com azul de tripano a 0,5%, e o número de células viáveis foi contado por hemacitómetro. Os resultados da contagem foram demonstrados como viabilidade percentual (número de células viáveis/número de células totais por poço × 100) para cada concentração de etanol e densidade de onda sonora. A viabilidade celular também foi avaliada utilizando o ensaio MTT. A atividade metabólica das células incubadas na presença de diferentes concentrações de etanol e onda sonora foi avaliada pelo ensaio MTT. Para preparar o MTT; 5 mg deste composto foram dissolvidos em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato. Após a incubação, 50 ml do meio sobrenadante são removidos para medir a atividade da lactato desidrogenase e, em seguida, 5 ml de estoque de MTT foram adicionados a cada poço. Após quatro horas de armazenamento a 37°C, a reação foi interrompida pela adição de 100 mL de DMSO ou 0,04 HCl normal em solução de isopropanol. Esta solução produz o cromóforo formazan precipitado púrpura dissolvido nas células e depois foi medida pelo leitor de placas ELISA a um comprimento de onda de 570 nm. Os resultados foram definidos e expressos como percentual da viabilidade do controle.
Determinação de ROS
A produção de ROS em cultura celular foi detectada usando uma sonda fluorescente de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCDHF) obtida da Sigma Aldrich. Este composto é uma molécula permeável às células sem carga. No citoplasma das células, esta sonda é clivada por esterase inespecífica e convertida para formar carboxidiclorofluorosceína, que é oxidada na presença de ERO. As culturas celulares foram carregadas com 10 M em meio isento de soro DCDHF durante 30 min a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas em meio e tratadas conforme indicado nas legendas das figuras. A espectroscopia de fluorescência foi monitorada por fluorímetro de microplacas, respectivamente utilizando comprimentos de onda de 485 nm para excitação e 538 nm para emissão.
Ensaio da enzima lactato desidrogenase (LDH)
Este ensaio é conduzido pela medição da enzima lactato desidrogenase citoplasmática (LDH), que está presente em todas as culturas celulares e quando as membranas plasmáticas são danificadas por apoptose, a enzima é liberada para os meios de cultura celular. Usando a atividade da enzima LDH, a morte celular é determinada. O aumento da quantidade de atividade de LDH no sobrenadante do meio de cultura celular correlaciona-se diretamente com a quantidade de formazan formada em um período de tempo limitado. A intensidade da cor vermelha no ensaio está correlacionada com o número de células lisadas. O corante formazan de cor vermelha indicou absorção em 500 nm, enquanto o tetrazólio não apresenta absorção neste comprimento de onda.
Avaliação da morfologia celular por microscopia de contraste de fase
A aparência das células controle e sob a influência de ondas sonoras e diversas concentrações de etanol foram estudadas por microscopia de contraste de fase.
Análise estatística
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) de três determinações independentes. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise de variância unidirecional (ANOVA) é usada para determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre as médias de três grupos (não relacionados).
Resultados
As células de astrócitos foram tratadas com diferentes concentrações de etanol em placas de 96 poços. Após 1, 2, 4 e 12 horas de tratamento, a taxa de sobrevivência das células foi medida pelo ensaio azul de tripano e MTT. O IC50 para etanol em células de astrócitos foi de 150 mM v/v do meio após uma hora de tratamento com etanol.
Figura 1: Um curso temporal de sobrevivência de células de astrócitos em função de várias concentrações de etanol. Alta concentração de etanol causa toxicidade à cultura de células de astrócitos: Em uma hora, tratamentos de cultura de células com várias concentrações de etanol e IC50 é de 150 mM em 1 h. As barras de erro são os intervalos de confiança (a=0,05).
Os resultados do ensaio de LDH indicaram que esta onda sonora (528 Hz com intensidade de 80) pode reduzir a atividade da lactato desidrogenase em cultura de células de astrócitos. A liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática no meio de cultura como marcador para diagnosticar a integridade das membranas celulares e, assim, detectar esta enzima no meio de cultura é motivo para apoptose celular. Em cultura de células de astrócitos tratadas com concentração variável de etanol e depois tratadas com onda sonora de 528 Hz, observou-se que a liberação de LDH reduziu cerca de 20% quando foi utilizada a intensidade da onda sonora de 80 dB. Em outro momento foi demonstrado que na cultura celular tratada com etanol 150 mM (CI50 do etanol) em uma hora e depois tratada com intensidade de 100 dB, a liberação de LDH não sofreu alteração significativa em relação ao controle e na intensidade de 120 dB, a a liberação de LDH aumentou em comparação com etanol 150 mM em uma hora (Figura 2).
Figura 2: Efeitos da onda sonora na cultura de células de astrócitos em IC50 de etanol pelo ensaio MTT: em IC50 de etanol a onda sonora melhorou a viabilidade celular em 80dB de 528Hz até 20%. Também em 100dB a viabilidade celular melhorou, mas em 120dB a viabilidade celular não muda com o etanol IC50. As barras de erro são os intervalos de confiança (a=0,05).
Avaliar os efeitos do etanol e da onda sonora na produção de EROs em cultura de células, cultura de células primárias de astrócitos tratadas com etanol e onda sonora em etanol IC50 (150 mM e 1 h). Na cultura celular tratada com etanol 150 mM, a produção de ERO aumentou significativamente (Figura 3).
Figura 3: Efeitos da onda sonora na cultura de células de astrócitos em IC50 de etanol por ensaio de LDH: a liberação de LDH demonstrou apoptose em cultura de células. A cultura de células de astrócitos com etanol IC50 e onda sonora em 80 db e 528 Hz pode prevenir a morte celular. Além disso, em 100 dB pequenas alterações são dispensadas, mas em 120 dB a morte celular aumenta no etanol IC50. As barras de erro são os intervalos de confiança (a=0,05).
Para detectar a produção de ROS em cultura celular foi utilizado DCHF. As produções de ERO em cultura de células tratadas com onda sonora de 528 Hz com todas as frequências reduzidas e usando apenas etanol para tratamento, a produção de ERO no meio celular aumentou significativamente. Ao contrário da percepção, o tratamento das células com onda sonora em 528 Hz após o tratamento com etanol apresentou resultados interessantes baseados na redução da produção de EROs. A onda sonora também utilizada no etanol IC50 (150 mM em uma hora) demonstrou que a redução da produção de ROS na cultura celular pode aumentar a viabilidade celular (Figura 4).
Figura 4: Efeitos da onda sonora na cultura de células de astrócitos em IC50 de etanol por ensaio de ROS: a onda sonora de 80 dB e 528 Hz reduziu a produção de ROS na cultura de células de astrócitos. Além disso, quando se usa etanol e ondas sonoras simultaneamente, a produção de ROS é reduzida como o tratamento de ondas sonoras.
A alteração morfológica na cultura de células de astrócitos tratadas com etanol e onda sonora demonstrou que o uso de onda sonora de 528 Hz com intensidade de 80dB em células de astrócitos tratadas com etanol IC50 reduziu relativamente a taxa de morte celular (Figura 5).
Figura 5: Alteração morfológica dos astrócitos por tratamento com etanol e onda sonora. A: cultura primária de astrócitos. B: astrócito com etanol 150 mM em uma hora (etanol IC50). C: Célula de astrócitos tratada com etanol e frequência de 528 Hz e intensidade da onda sonora de 80 dB.
Discussão
O consumo crônico de álcool como fator-chave na destruição do tecido cerebral, altamente considerado pelos pesquisadores. O principal efeito do álcool nas células cerebrais é a produção de ERO nos astrócito [18]. No presente estudo, investigamos os efeitos iniciais do etanol agudo em cultura de células primárias de astrócitos do hipocampo humano expostas ao etanol. Os resultados mostraram que o etanol pode ser produzido ERO em células que este produziu ERO em concentrações fisiológicas pode desencadear muitas vias de sinalização, embora também seja impotente na regulação de algumas vias. Por outro lado, a concentração excessiva de ROS pode ser potencialmente tóxica [19]. As células dos astrócitos são a primeira barreira contra o estresse oxidativo induzido pelo etanol e com a metabolização do etanol têm papel protetor para os neurônios [20]. A metabolização do etanol é induzida pela catalase, citocromo P450 e álcool desidrogenase [21].
O objetivo deste estudo é determinar frequências que possam ter propriedades benéficas, como melhoria da viabilidade ou redução na produção de EROs em nível celular. Também parece que a onda sonora na frequência de 528 Hz, que às vezes é chamada de tom milagroso, poderia proporcionar tranquilidade e uma fonte de alívio do estresse. É interessante notar que esta frequência tem capacidade de alterar a interação física das moléculas de água com cada uma e pode iniciar a formação de um aglomerado que poderia efetivamente melhorar o reparo do DNA. A frequência de 528 Hz é conhecida como o agente não invasivo que pode ativar o reparo do DNA agrupando a molécula de H2O [17]. Aqui mostramos que a pré-incubação da cultura de células primárias de astrócitos com etanol pode ser produzida ROS levando ao estresse oxidativo em cuja condição ocorre a morte celular e o ensaio de MTT e azul de tripano comprova esse fato. IC50 para etanol é 15 mM de etanol em uma hora. A LDH libertada em meio de cultura celular em etanol 150 mM mostra que nesta concentração 50% das células são viáveis.
Além disso, nossos resultados mostram que a produção de EROs em resposta ao etanol pode ser reduzida na presença de onda sonora de 528 Hz. Entre as diversas intensidades da onda sonora de 528 Hz, 80 dB é a melhor intensidade para reduzir a produção de ROS. A produção de ROS é reduzida em 528 Hz com intensidade de 80 dB e também afeta a viabilidade celular e a liberação de LDH. A viabilidade celular na presença de etanol e ondas sonoras aumentou até 20%. O quadro morfológico pode ser uma prova de morte celular em cultura de células primárias de astrócitos tratadas com etanol e onda sonora de 528 Hz.
Este resultado sugere que o uso de onda sonora de 528 Hz com intensidade de 80 dB reduz os efeitos colaterais do consumo de etanol na cultura de células primárias de astrócitos e pode ser uma boa ideia para reduzir os efeitos danosos do álcool em pessoas viciadas em álcool e estudos futuros abrirão um caminho para eliminando os efeitos destrutivos do álcool até que o tratamento da dependência seja mais suave.
Conclusão
Os comprimentos de onda comuns existentes no ambiente humano, além de criarem o sentido psicológico, ao alterarem as reações intracelulares, desempenharão um papel importante na resposta das células a fatores ambientais como drogas e álcool. Portanto, o uso destas ondas sonoras pode ser útil para reduzir os efeitos tóxicos do etanol na cultura de células de astrócitos.
Reconhecimento
Os autores agradecem o apoio financeiro desta investigação por parte do Conselho de Pesquisa da Universidade de Teerã. Além disso, ambos os autores declaram não ter conflito de interesses neste relatório.
Referências e Links
